RNA dà-shreath (dsRNA) ELISA KIT

Tha am pasgan seo na Mheasadh Immunosorbent Enzyme-Ceangailte (ELISA) a’ ceangal ri siostam biotin-Streptavidin, airson tomhas cainneachdail de dsRNA le fad os cionn 60 paidhrichean bonn (bp), ge bith dè an t-sreath.Tha an truinnsear air a bhith air a chòmhdach ro-làimh le antibody anti-dsRNA.tha dsRNA a tha an làthair san sampall air a chur ris agus a’ ceangal ri antibodies còmhdaichte air na tobraichean.Agus an uairsin thèid antibody anti-dsRNA biotinylated a chur ris agus a cheangal ri dsRNA san sampall.Às deidh nighe, thèid HRP-Streptavidin a chur ris agus a cheangal ris an antibody anti-dsRNA Biotinylated.Às deidh goir tha HRP-Streptavidin gun cheangal air a nighe air falbh.An uairsin tha fuasgladh substrate TMB air a chur ris agus air a chatalachadh le HRP gus toradh dath gorm a thoirt gu buil a dh ’atharraich gu buidhe às deidh dha fuasgladh stad searbhagach a chuir ris.Tha dùmhlachd buidhe ann an co-rèir ris an ìre targaid de dsRNA a chaidh a ghlacadh ann am plàta.Tha an sùghadh air a thomhas aig 450 nm.

Iarrtas

Tha am pasgan seo airson tomhas cainneachdail de dsRNA a tha air fhàgail.

Co-phàirtean kit

Stòradh agus Seasmhachd

1. Airson pasgan nach eil air a chleachdadh: Dh'fhaodadh an cromag gu lèir a bhith air a stòradh aig 2 ~ 8 ℃ ann am beatha sgeilp.Bu chòir solas làidir a sheachnadh airson seasmhachd stòraidh.

2. Airson pasgan cleachdte: Cho luath ‘s a bhios am microplate air fhosgladh, feuch an còmhdaich thu tobraichean nach eilear a’ cleachdadh le sealer truinnsear agus till air ais chun phòla foil anns a bheil am pasgan desiccant, seula zip am poca foil agus till air ais gu 2 ~ 8 ℃ cho luath ‘s a ghabhas às deidh a chleachdadh.Bu chòir ath-bheachdan eile a thilleadh gu 2 ~ 8 ℃ cho luath ‘s a ghabhas às deidh an cleachdadh.

Stuthan a dhìth ach nach eil air an toirt seachad

1. Leughadair microplate le sìoltachan 450±10nm (nas fheàrr ma lorgar e aig tonn-tonn 450 agus 650 nm).

2. Microplate shaker.

3. Molaidhean gun RNase agus tiùban centrifuge.

Clàr-sruth obrachaidh

Mus tòisich thu

1. Thoir a h-uile pàirt cromag agus sampallan gu teòthachd an t-seòmair (18-25 ℃) mus cleachd thu iad.Mura tèid am pasgan a chleachdadh ann an aon àm, feuch nach toir thu a-mach ach stiallan agus ath-bheachdan airson an deuchainn làithreach, agus fàg na stiallan agus na h-ath-bheachdan a tha air fhàgail ann an staid a tha a dhìth.

2. Bufair nighe: caolaich 40mL de bhufair nighe dùmhail 20 × le 760mL de dh’ uisge deionized no grùide gus 800mL de bhufair nighe 1 × ullachadh.

3. Coitcheann: goirid snìomh no centrifuge an stoc fuasgladh mus cleachdadh.Is e an dùmhlachd de cheithir inbhean 5ng / μL.Airson inbhean UTP agus pUTP dsRNA, feuch an lughdaich thu am fuasgladh stoc gu 1,0.5,0.25,0.125,0.0625,0.0312,0.0156,0pg / μL le bufair STE gus an lùb àbhaisteach a tharraing.Airson inbhean N1-Me-pUTP dsRNA, feuch an lughdaich thu am fuasgladh stoc gu 2,1,0.5,0.25,0.125,0.0625,0.0312, 0pg / μL le bufair STE gus an lùb àbhaisteach a tharraing.Airson inbhe 5-OMe-UTP dsRNA, feuch an lughdaich thu am fuasgladh stoc gu 4,2,1,0.5, 0.25,0.125,0.0625, 0pg / μL le bufair STE gus an lùb àbhaisteach a tharraing.Tha sinn a’ moladh gum faodar inbhean a lagachadh mar chlàran a leanas:

4. Antibody lorg biotinylated agus fuasgladh obrach HRP-streptavidin: snìomh goirid no centrifuge am fuasgladh stoc mus tèid a chleachdadh.Lùghdaich iad gu dùmhlachd obrach le bufair caolachaidh.

5. Fo-stàit TMB: miannaich an dòs a tha a dhìth den fhuasgladh le molaidhean sterilized agus na cuir a-steach am fuasgladh a tha air fhàgail a-steach don vial a-rithist.Tha substate TMB mothachail air solas, na bi a’ nochdadh substrate TMB gu solas airson ùine mhòr.

A 'cleachdadh protocol

1. Obraich a-mach an àireamh de stiallan a tha a dhìth airson an assay.Cuir a-steach na stiallan anns na frèamaichean airson a chleachdadh.Bu chòir na stiallan truinnsear a tha air fhàgail nach eilear a’ cleachdadh san assay seo a bhith air an ath-phacadh sa bhaga le desiccant.Dùin am baga gu teann airson stòradh fuarachaidh.

2. Cuir 100μL gach aon de na caolaidhean de àbhaisteach, bàn agus sampaill a-steach do na tobraichean iomchaidh.Còmhdaich le sealer truinnsear.Goir airson 1 uair aig teòthachd an t-seòmair le crathadh aig 500rpm.Bu chòir na sampallan a bhith air an lagachadh le bufair STE gu dùmhlachd iomchaidh airson measadh ceart.

3. Ceum nighe: Aspirate am fuasgladh agus nigh le 250μL bufair nighe gu gach tobar agus leig e seasamh airson 30s.Thoir air falbh bufair nighe gu tur le bhith a’ snaidheadh ​​a’ phlàta air pàipear sùghaidh.Nigh gu tur 4 tursan.

4. Cuir 100μL de fhuasgladh obrach antibody lorg biotinylated a-steach do gach tobar.Còmhdaich le sealer truinnsear.Goir airson 1 uair aig teòthachd an t-seòmair le crathadh aig 500rpm.

5. Dèan a-rithist ceum nighe.

6. Cuir 100μL de fhuasgladh obrach HRP-streptavidin a-steach do gach tobar.Còmhdaich le sealer truinnsear.Goir airson 30 mionaid aig teòthachd an t-seòmair le crathadh aig 500rpm.

7. Dèan ceum nighe a-rithist.

8. Cuir 100μL de fhuasgladh substrate TMB a-steach do gach tobar.Còmhdaich le sealer truinnsear.Goir airson 30 mionaid aig RT Dìon bho sholas.Tionndaidhidh an leaghan gorm le bhith a’ cur fuasgladh substrate ris.

9. Cuir 50μL de fhuasgladh stad a-steach do gach tobar.Tionndaidhidh an leaghan buidhe le bhith a’ cur fuasgladh stad ris.An uairsin ruith an leughadair microplate agus giùlain tomhas aig 450nm sa bhad.

Àireamhachadh nan Toraidhean

1. Cuibheasach na leughaidhean dùblaichte airson gach inbhe, smachd, agus sampaill agus thoir air falbh an dùmhlachd optigeach àbhaisteach àbhaisteach neoni.Tog lùb àbhaisteach le sùghadh air an axis dhìreach (Y) agus dùmhlachd dsRNA air an axis chòmhnard (X）.

2. Thathas a 'moladh an àireamhachadh a dhèanamh le bathar-bog inneal lùbte stèidhichte air coimpiutair leithid eòlaiche lùb 1.3 no ELISA Calc ann am modail freagarrach neo-loidhneach paramadair 5 no 4.

Coileanadh

1. Cugallachd:

crìoch lorgaidh nas ìsle: ≤ 0.001pg / μL (airson UTP-, pUTP-, N1-Me-pUTP-dsRNA), ≤ 0.01pg / μL (airson 5-OMe-UTP-dsRNA).

crìoch àireamhachaidh nas ìsle: 0.0156 pg / μL (airson UTP-, pUTP-dsRNA), 0.0312 pg / μL (airson N1-Me-pUTP-dsRNA), 0.0625 pg / μL (airson 5-OMe-UTP-dsRNA).

2. Precision: CV de Intra-Assay ≤10%, CV de Inter-Assay ≤10%

3. Ath-bheothachadh: 80% ~ 120%

4.Linearity: 0.0156-0.5pg/μL (airsonUTP-,pUTP-dsRNA) 0.0312-1pg/μL (airsonN1-Me-pUTP dsRNA), 0.0625-1pg/μL (airson 5-OMe-UTP-dsRNA).

Beachdachaidhean

1. Tha teòthachd agus ùine ath-bhualadh TMB deatamach, feuch an smachd a chumail orra a rèir an stiùiridh gu teann.

2. Gus deagh ath-riochdachadh agus cugallachd assay a choileanadh, tha e riatanach na truinnsearan a nighe gu ceart gus cus ath-bheachdan neo-fhreagairt a thoirt air falbh.

3. Bu chòir na h-ath-bheachdan uile a mheasgachadh gu mionaideach mus tèid an cleachdadh agus bumbles a sheachnadh nuair a thèid sampall no ath-bheachdan a chur ris.

4. Ma tha criostalan air cruthachadh anns a' bhufair nighe dùmhail (20x), blàth gu 37 ℃ agus measgachadh gu socair gus am bi na criostalan air an sgaoileadh gu tur.

5. Seachain measadh air sampallan anns a bheil Sòidiam Azide (NaN3), oir dh'fhaodadh e gnìomhachd HRP a sgrios agus mar thoradh air sin cha bhiodh an ìre de dsRNA air a mheas gu leòr.

6. Seachain truailleadh RNase rè assay.

7. Faodar an inbhe/sampall, antibody lorgaidh agus SA-HRP a dhèanamh cuideachd aig RT gun chrith, ach dh'fhaodadh seo lùghdachadh mothachadh lorgaidh aon-fhillte.Airson a ’chùis seo, tha sinn a’ moladh gum bu chòir inbhean UTP agus pUTP dsRNA a bhith air an lagachadh bho 2pg / μL, bu chòir inbhean N1-Me-pUTP dsRNA a lagachadh bho 4pg / μL agus 5-OMe-UTP dsRNA inbhe a bhith air a lagachadh bho 8pg / μL.A bharrachd air an sin, goir fuasgladh obrach HRP-streptavidin airson 60min aig teòthachd an t-seòmair.Na cleachd flask shaker, oir dh’ fhaodadh toradh mearachdach a bhith mar thoradh air crathadh flasg.

Toradh àbhaisteach

1. Dàta lùb àbhaisteach

2. Àireamhachadh lùb àbhaisteach

3. Raon lorgaidh lìnidh: 0.0312- 1pg/μL