M-MLV Reverse Transcriptase
Gheibhear transcriptase RevScript Reverse le teicneòlas innleadaireachd ginteil.Tha comas synthesis cDNA nas àirde aige, seasmhachd teirmeach agus crìoch teòthachd freagairt (suas gu 60 ° C).Tha an toradh cDNA synthesized suas ri 10 kb.Bidh e ag àrdachadh dàimh nan teamplaidean agus tha e freagarrach airson ath-sgrìobhadh air ais de theamplaidean RNA le structar àrd-sgoile iom-fhillte no ginean leth-bhreac ìosal.
Co-phàirtean
| Comh-phàirt | HC2003B (10,000U) | HC2003B (5*10,000U) | HC2003B (200,000U) |
| Ath-sgrìobhadh RevScript Reverse (200U/μL) | 50 μL | 5 × 50 μL | 1 ml |
| 5 × RevScript Bufair | 250 μL | 1.25 mL | 5 ml |
Suidheachadh stòraidh
Bu chòir an toradh seo a stòradh aig -25 ° C ~ -15 ° C airson 2 bhliadhna.
Mìneachadh Aonad
Bidh aon aonad a’ toirt a-steach 1 nmol de dTTP a-steach do stuth searbhagach-soluble ann an 10 mionaidean aig 37 ° C a’ cleachdadh Oligo (dT) mar primers.
Suidheachadh freagairt
1.Neo-nàdurachadh teamplaid RNA (Tha an ceum seo roghainneil, bidh dì-nàdarachadh teamplaid RNA a’ cuideachadh le bhith a’ fosgladh nan structaran àrd-sgoile, a leasaicheas toradh a’ chiad dualan cDNA.)
| Co-phàirtean | Meud (μL) |
| RNase ddH saor an asgaidh2O | Gu 13 |
| Oligo(dT)18 (50 μmol/L) no Random Primer (50 μmol/L) No Primers Sònraichte Gine (2 μmol/L) | 1 |
| neo 1 | |
| neo 1 | |
| Teamplaid RNA | X a |
Notaichean:
1) a: RNA iomlan: 1-5 ug no mRNA: 1-500 ng
2) Goir aig 65 ° C airson 5 mionaidean, an uairsin a 'gluasad air deigh sa bhad gus fuarachadh airson 2 mhionaid.Centrifugation goirid gus leaghan ath-bhualadh a chruinneachadh, cuir ris an fhuasgladh freagairt ath-sgrìobhaidh cùil mar a chithear sa chlàr a leanas.Pìob gu socair airson measgachadh.
1.Ag ullachadh a 'mheasgachaidh freagairt (20 μL volume)
| Co-phàirtean | Meud (μL) |
| Measgachadh den cheum roimhe | 13 |
| 5 × Bufair | 4 |
| dNTP measgachadh (10nmol/L) | 1 |
| Ath-sgrìobhadh air ais (200 U/μL) | 1 |
| Neach-dìon RNase (40 U / μL) | 1 |
1.Dèan am freagairt fo na cumhaichean a leanas:
| Teòthachd (°C) | Uair |
| 25 °Ca | 5 mionaidean |
| 42°Cb | 15-30 mionaid |
| 85 °Cc | 5 mionaidean |
Notaichean:
1) a.Chan eil feum air goir aig 25 ° C airson 5 mionaidean ach airson hexamers air thuaiream a chleachdadh.Feuch an leum thu air a’ cheum seo nuair a bhios tu a’ cleachdadh Oligo (dT)18no Generator Sònraichte.
2) b.Is e an teòthachd tar-chuir cùil a thathar a’ moladh 42 ° C, Airson teamplaidean le structaran àrd-sgoile iom-fhillte no susbaint àrd GC, thathas a’ moladh an teòthachd freagairt àrdachadh gu 50-55 ° C.
3) c.Teasachadh aig 85 ° C airson 5 mionaidean gus transcriptase cùil a chuir an gnìomh.
4) Faodar an toradh a chleachdadh gu dìreach ann an ath-bheachdan PCR no qPCR, no a stòradh aig -20 ° C airson stòradh geàrr-ùine.Thathas a’ moladh na toraidhean a cho-thaobhadh agus a stòradh aig -80 ° C airson stòradh fad-ùine.Seachain reothadh tric.
5) Tha an toradh freagarrach airson RT-qPCR aon-cheum, thathas a’ moladh 10-20 U reverse transcriptase a chuir ris airson gach siostam freagairt 25μL, no àrdachadh mean air mhean air an ìre de transcriptase cùil a rèir an t-suidheachaidh fhìor.
Notaichean
1.Feuch an cùm thu an raon deuchainneach glan;Bu chòir miotagan agus aghaidhean choimheach glan a chaitheamh rè an obrachaidh.Bu chòir a h-uile stuth consum a chaidh a chleachdadh san deuchainn a bhith saor bho RNase gus casg a chuir air truailleadh RNase.
2.Bu chòir a h-uile modh-obrach a dhèanamh air deigh gus casg a chuir air truailleadh RNA.
3.Thathas a’ moladh sampallan RNA de chàileachd àrd gus dèanamh cinnteach à àrd-èifeachdas ath-sgrìobhaidh air ais.
4.Tha an toradh seo airson cleachdadh rannsachaidh a-mhàin.
5.Feuch an obraich thu le còtaichean obair-lann agus miotagan cuidhteasach, airson do shàbhailteachd.
