mRNA Cap2'-O-Methyltransferase

Chaidh mRNA Cap 2’ -O-methyltransferase a thoirt a-mach à strain E. coli ath-chuimseach a bhios a’ giùlan gine airson an vaccinia mRNA Cap 2’-O-Methyltransferase.Bidh an enzyme seo a’ cur buidheann methyl ris aig suidheachadh 2’-O den chiad nucleotide ri taobh structar a’ chaip aig deireadh 5 an RNA. -0) mar thoradh air structar cap-1.

Faodaidh structar Cap1 èifeachdas eadar-theangachaidh àrdachadh, le bhith ag adhartachadh faireachdainn mRNA ann an deuchainnean tar-chuir agus micro-stealladh.Chan urrainn dha RNA a chleachdadh le pN, ppN, pppN no GpppN aig deireadh 5’.Faodar RNA caipte ullachadh tro ath-sgrìobhadh in vitro a’ cleachdadh analog cap no tro capadh enzymatic a’ cleachdadh an Vaccinia Capping Enzyme.

Co-phàirtean

mRNA Cap 2’-O-Methyltransferase (50U/μL)

10 × Bufair freagairt capping

Stòradh

-25 ～- 15 ℃ airson a stòradh (Seachain cearcallan reòta a-rithist)

Bufair stòraidh

20 mM Tris-HCl （pH 8.0 ， 25 ℃), 100 mM NaCl, 1 mM DTT, 0. 1 mM EDTA, 0. 1% Triton X- 100, 50% glicerol.

Mìneachadh aonad

Tha aon aonad air a mhìneachadh mar an ìre de enzyme a dh’ fheumar gus methylate 10 pmoles de 80 nt tar-sgrìobhadh RNA le caiptean ann an 1 uair aig 37 ° C.

Measaidhean smachd càileachd

Exonuclease: 50U de mRNA Cap 2 ’-O-Methyltransferase le 1μg λ-Hind III cnàmhadh DNA aig 37 ℃ airson 16 uairean a’ toirt a-mach gun truailleadh mar a chaidh a dhearbhadh le electrophoresis gel agarose.

Endonuclease: 50 U de mRNA Cap 2 ’-O-Methyltransferase le 1 μg λDNA aig 37 ℃ airson 16 uairean a’ toirt a-mach gun truailleadh sam bith mar a chaidh a dhearbhadh le electrophoresis gel agarose.

Nickase: 50U de mRNA Cap 2 ’-O-Methyltransferase le 1μg pBR322 aig 37 ℃ airson 16 uairean a’ toirt a-mach gun truailleadh mar a chaidh a dhearbhadh le electrophoresis gel agarose.

RNase: 50U de mRNA Cap 2 ′ -O-Methyltransferase le 1.6μg MS2 RNA airson 4 uairean aig 37 ℃ toradh gun truailleadh mar a chaidh a dhearbhadh le electrophoresis gel agarose.

E. coli DNA: 50U de mRNA Cap 2 ’-O-Methyltransferase air a sgrìobadh airson làthaireachdE. coli DNA genomic a’ cleachdadh TaqMan qPCR le primers sònraichte airson anE. coli 16S rRNA locus.Tha anE. coli Is e truailleadh DNA genomic = 1E. coli genoma.

Bataraidh Endotoxin: LAL-deuchainn, a rèir deasachadh Sìneach Pharmacopoeia IV 2020, modh deuchainn crìoch gel, riaghailt choitcheann (1143).Bu chòir susbaint endotoxin bacterial a bhith = 10 EU / mg.

Siostam freagairt agus suidheachaidhean

1. Cuir còmhla meud iomchaidh de RNA Capped agus H2O gun RNase ann an tiùb microfuge 1.5 mL gu leabhar deireannach de 16.0 µL.

2. Teas aig 65 ℃ airson 5 mionaidean agus an uair sin amar-deighe airson 5 mionaidean.

3. Cuir na co-phàirtean a leanas ris san òrdugh a chaidh a shònrachadh (airson methylation of Capped RNA

nas lugha na 10

* 10 × Bufair freagairt capaidh: 500 mM Tris-HCl (pH 8.0, 25 ℃), 50 mM KCl, 10 mM MgCl2 , 10 mM DTT.

4. Goir aig 37 ℃ airson 1 uair (thathas a' moladh 2 uair de ghoir airson a' chriomag targaid nas lugha na 200 nt).

Iarrtasan

Gus faireachdainn mRNA a leasachadh tro dheuchainnean micro-stealladh agus tar-chuir.

Notaichean mu chleachdadh

1. Mus tèid ath-bhualadh, bu chòir RNA a ghlanadh agus a sgaoileadh ann an uisge gun nuclease, cha bu chòir EDTA agus ions sam bith a bhith anns na fuasglaidhean uile.

2. Thathas a' moladh an sampall RNA a theasachadh aig 65 ℃ airson 5 mionaidean ron fhreagairt gus an structar àrd-sgoile a thoirt air falbh air deireadh 5 den tar-sgrìobhadh.Dh’ fhaodadh e a bhith air a leudachadh gu 10 mionaidean airson structar iom-fhillte 5 ’-terminal.