PNGase F
Is e Peptide-N-Glycosidase F (PNGase F) an dòigh enzymatic as èifeachdaiche airson cha mhòr a h-uile oligosaccharides ceangailte ri N a thoirt air falbh bho glycoproteins.Is e amidase a th’ ann am PNGase F, a bhios a’ ceangal eadar an còrr de GlcNAc a-staigh agus fuigheall asparagine de oligosaccharides àrd mannose, hybrid, agus iom-fhillte bho glycoproteins ceangailte ri N.
Iarrtas
Tha an enzyme seo feumail airson fuigheall gualaisg a thoirt air falbh bho phròtainean.
Ullachadh agus sònrachadh
| Coltas | Liquid gun dath |
| Purity pròtain | ≥95% (bho SDS-PAGE) |
| Gnìomhachd | ≥500,000 U/mL |
| Exoglycosidase | Cha deach gnìomhachd sam bith a lorg (ND) |
| Endoglycosidase F1 | ND |
| Endoglycosidase F2 | ND |
| Endoglycosidase F3 | ND |
| Endoglycosidase H | ND |
| Protease | ND |
Feartan
| EC àireamh | 3.5.1.52(Ath-mheasgachadh bho meanbh-fhàs-bheairtean) |
| Molecular cuideam | 35 kDa (SDS-DUILLEAG) |
| Puing isoelectric | 8. 14 |
| pH as fheàrr | 7.0-8.0 |
| An teòthachd as fheàrr | 65 °C |
| Sònrachadh substrate | A' glanadh cheanglaichean glycosidic eadar GlcNAc agus fuigheall asparagine Fig.1 |
| Làraich aithneachaidh | Glycanan ceangailte ri N mura h-eil α1-3 fucose ann. Fig. 2 |
| Gnìomhaichean | DTT |
| Neach-bacadh | SDS |
| Teòthachd stòraidh | -25 ~ -15 ℃ |
| Neo-ghnìomhachd teas | Tha measgachadh freagairt 20µL anns a bheil 1µL de PNGase F air a chuir an gnìomh le bhith a’ goir aig 75 ° C airson 10 mionaidean. |
Fig. 1 Sònrachas fo-roinn PNGase F
Fig. 2 Tha aithne na shuidhe air PNGase F.
Nuair a tha fuigheall GlcNAc a-staigh ceangailte ri fucose α1-3, chan urrainn do PNGase F oligosaccharides ceangailte ri N a ghlanadh bho glycoproteins.Tha am mion-atharrachadh seo cumanta ann an lusan agus cuid de glycoproteins bhiastagan.
Cluchd-dùbhlain
|
| Co-phàirtean | dùmhlachd |
| 1 | PNGase F | 50 µl |
| 2 | Bufair dì-nàdurrach 10 × Glycoprotein | 1000 µl |
| 3 | 10 × GlycoBuffer 2 | 1000 µl |
| 4 | 10% NP-40 | 1000 µl |
Mìneachadh aonad
Tha aon aonad (U) air a mhìneachadh mar an ìre de enzyme a dh’ fheumar gus> 95% den charbohydrate a thoirt air falbh bho 10 µg de RNase B neo-nàdurrach ann an 1 uair aig 37 ° C ann an tomhas freagairt iomlan de 10 µL.
Suidheachaidhean freagairt
1.Dissolve 1-20 µg de glycoprotein le uisge deionized, cuir 1 µl 10 × Glycoprotein Denaturing Buffer agus H2O (ma tha sin riatanach) gus meud freagairt iomlan 10 µl a dhèanamh.
2.Goir aig 100 ° C airson 10 mionaidean, fuaraich e air deigh.
3.Cuir 2 µl 10 × GlycoBuffer 2, 2 µl 10% NP-40 ris agus measgachadh.
4.Cuir 1-2 µl PNGase F agus H2O (ma tha sin riatanach) gus tomhas-lìonaidh iomlan de 20 µl a dhèanamh agus measgachadh.
5.Goir ath-bhualadh aig 37 ° C airson 60 mionaid.
6.Airson mion-sgrùdadh SDS-PAGE no mion-sgrùdadh HPLC.
