Enzyme capping bhìoras Vaccinia
Tha enzyme capaidh bhìoras Vaccinia a’ tighinn bho strain E. coli ath-chuimseach a’ giùlan nan ginean airson an einnsein capaidh Vaccinia.Tha an aon enzym seo air a dhèanamh suas de dhà fho-aonad (D1 agus D12) agus tha trì gnìomhan enzymatic aige (RNA triphosphatase agus guanylyltransferase leis an subunit D1 agus guanine methyltransferase leis an subunit D12).Tha Enzyme Capping bhìoras Vaccinia èifeachdach gus cruthachadh structar caip a bhrosnachadh, a dh’ fhaodas structar caip 7-methylguanylate (m7Gppp, Cap 0) a cheangal gu sònraichte ri deireadh 5 ′ de RNA.Tha pàirt cudromach aig structar caip (Cap 0) ann an seasmhachd mRNA, còmhdhail agus eadar-theangachadh ann an eukaryotes.Tha capadh RNA le ath-bhualadh enzymatic na dhòigh èifeachdach is sìmplidh a dh’ fhaodadh leasachadh mòr a thoirt air seasmhachd agus eadar-theangachadh RNA airson tar-sgrìobhadh in vitro, tar-chuir, agus meanbh-stealladh.
Co-phàirtean
Enzyme capping bhìoras Vaccinia (10 U/μL)
10 × Bufair capping
Suidheachadh stòraidh
-25 ～ - 15 ℃ airson stòradh (Seachain cearcallan reothadh is leaghaidh a-rithist)
Bufair stòraidh
20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 100 mM NaCl,
1mM DTT, 0. 1mM EDTA, 0. 1% Triton X- 100, 50% glicerol.
Mìneachadh Aonad
Tha aon aonad de bhìoras Vaccinia Capping Enzyme air a mhìneachadh mar an ìre de enzyme a dh’ fheumar gus 10pmol de GTP a thoirt a-steach do thar-sgrìobhadh 80nt ann an 1 uair aig 37 ° C.
Smachd Càileachd
Exonuclease:Chan eil 10U de bhìoras Vaccinia Capping Enzyme le 1μg λ-Hind III cnàmhadh DNA aig 37 ℃ airson 16 uairean a ’toirt a-mach truailleadh sam bith mar a chaidh a dhearbhadh le electrophoresis gel agarose.
Endonuclease:Chan eil 10U de bhìoras Vaccinia Capping Enzyme le 1μg λDNA aig 37 ℃ airson 16 uairean a ’toirt a-mach truailleadh sam bith mar a chaidh a dhearbhadh le electrophoresis gel agarose.
Nickase:Chan eil 10U de bhìoras Vaccinia Capping Enzyme le 1 μg pBR322 aig 37 ℃ airson 16 uairean a ’toirt a-mach truailleadh sam bith mar a chaidh a dhearbhadh le electrophoresis gel agarose.
RNase:Chan eil 10U de bhìoras Vaccinia Capping Enzyme le 1.6μg MS2 RNA airson 4 uairean aig 37 ℃ a ’toirt a-mach truailleadh sam bith mar a chaidh a dhearbhadh le electrophoresis gel agarose.
1.DNA coli:Tha 10U de bhìoras Vaccinia Capping Enzyme air a sgrìobadh airson làthaireachd DNA genomic E. coli a’ cleachdadh TaqMan qPCR le primers sònraichte airson an locus rRNA E. coli 16S.Is e an truailleadh DNA genomic E. coli ≤1 E. coli genome.
2.Bataraidh Endotoxin: LAL-deuchainn, a rèir deasachadh Sìneach Pharmacopoeia IV 2020, modh deuchainn crìoch gel, riaghailt choitcheann (1143).Bu chòir susbaint endotoxin bacterial a bhith ≤10 EU / mg.
Siostam freagairt agus suidheachaidhean
1. Capping Protocol (meur freagairt: 20 μL)
Tha am modh-obrach seo buntainneach ri ath-bhualadh capaidh RNA 10μg (≥100 nt) agus faodar a mheudachadh a rèir iarrtasan deuchainneach.
I) Cuir còmhla 10μg RNA agus H2O gun niùclas ann an tiùb microfuge 1.5 ml gu leabhar deireannach de 15.0 µL.* 10 × Bufair capaidh: 0.5M Tris-HCl, 50 mM KCl, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, (25 ℃, pH 8.0)
2) Teas aig 65 ℃ airson 5 mionaidean agus an uairsin amar deigh airson 5 mionaidean.
3) Cuir na co-phàirtean a leanas ris san òrdugh a chaidh a shònrachadh
| Cnaimhdeas | Volum |
| RNA dì-nàdurrach (≤10μg, fad≥100 nt) | 15 μL |
| 10 × Bufair cuibhreachaidh* | 2 μL |
| GTP (10 mM) | 1 µL |
| SAM (2 mM) | 1 µL |
| Enzyme capping bhìoras Vaccinia (10U/μL) | 1 µL |
* 10 × Bufair capaidh: 0.5 M Tris-HCl, 50 mM KCl, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, (25 ℃, pH8.0)
4) Goir aig 37 ° C airson 30 mionaid, tha RNA a-nis air a chuingealachadh agus deiseil airson tagraidhean sìos an abhainn.
2. 5 ′ ceann-uidhe freagairt labeling (tomhas-lìonaidh freagairt: 20 μL)
Tha am protocol seo air a dhealbhadh gus RNA a chomharrachadh anns a bheil triphosphate 5’ agus faodar a mheudachadh a rèir iarrtasan.Bidh buaidh air èifeachdas cuir a-steach leubail le co-mheas molar RNA: GTP, a bharrachd air susbaint GTP ann an sampallan RNA.
1) Cuir còmhla meud iomchaidh de RNA agus H2O gun niùclas ann an tiùb microfuge 1.5 ml gu leabhar deireannach de 14.0 µL.
2) Teas aig 65 ℃ airson 5 mionaidean agus an uairsin amar deigh airson 5 mionaidean.
3) Cuir na co-phàirtean a leanas san òrdugh a chaidh a shònrachadh.
| Cnaimhdeas | Volum |
| RNA dì-nàdurrach | 14 μL |
| 10 × Bufair capping | 2 μL |
| measgachadh GTP** | 2 μL |
| SAM (2 mM) | 1 µL |
| Enzyme capping bhìoras Vaccinia (10U/μL) | 1 µL |
** Tha GTP MIX a’ toirt iomradh air GTP agus àireamh bheag de chomharran.Airson an dùmhlachd de GTP, thoir sùilgu nota 3.
4) Goir aig 37 ° C airson 30 mionaid, tha deireadh RNA 5 ′ a-nis air a chomharrachadh agus deiseil airson sìos an abhainn
Iarrtasan
1. A' cur crìoch air mRNA ro mheasaidhean eadar-theangachaidh/eadar-theangachadh in vitro
2. Labeling 5' deireadh mRNA
Notaichean mu chleachdadh
1.Le bhith a’ teasachadh fuasgladh RNA mus tèid a ghoir leis an Vaccinia Capping Enzyme bheir sin air falbh structar àrd-sgoile air ceann 5’ an tar-sgrìobhaidh.Leudaich an ùine gu 60 mionaid airson ath-sgrìobhaidhean le cinn-uidhe làn structarail aithnichte.
2. Bu chòir RNA a thathar a' cleachdadh airson ath-bhualaidhean capaidh a ghlanadh mus tèid a chleachdadh agus a chrochadh ann an uisge gun nuclease.Cha bu chòir EDTA a bhith an làthair agus bu chòir gum biodh am fuasgladh saor bho shalainn.
3. Airson a bhith a' comharrachadh a' cheann 5', bu chòir gum biodh an dùmhlachd GTP iomlan timcheall air 1-3 tursan nas àirde na molar mRNA san fhreagairt.
4. Faodar meud an t-siostam ath-bhualadh a mheudachadh no sìos a rèir an fhìor.
