Ath-sgrìobhadh RTL Reverse
Tha RTL reverse transcriptase na polymerase DNA a tha an urra ri teamplaid RNA aig nach eil gnìomhachd exonuclease 3’ → 5 ’agus aig a bheil gnìomhachd RNase H.Faodaidh an enzym seo RNA a chleachdadh mar theamplaid gus iallan co-phàirteach de DNA a cho-chur, a dh’ fhaodar a chuir an sàs ann an synthesis cDNA sa chiad dual, gu sònraichte airson RT-LAMP (leudachadh isothermal le meadhan lùb).An coimeas ri RTL reverse transcriptase 1.0, tha an cugallachd air a leasachadh gu mòr, tha an seasmhachd teirmeach nas làidire, agus tha an ath-bhualadh aig 65 ° C nas seasmhaiche.Faodar transcriptase reverse RTL (saor bho glycerol) a chleachdadh gus ullachadh lyophilized ullachadh, ath-bheachdan RT-LAMP lyophilized msaa.
Mìneachadh Aonad
Tha aon aonad a’ toirt a-steach 1 nmol de dTTP a-steach do stuth searbhagach ann an 20 mionaid aig 50 ° C a’ cleachdadh poly(A)•oligo(dT)25 mar template-primer.
Co-phàirtean
| Comh-phàirt | HC5008A-01 | HC5008A-02 | HC5008A-03 |
| RTL Reverse Transcriptase (Gun glycerol) (15U / μL) | 0.1 ml | 1 ml | 10 ml |
| Bufair RTL 10 × HC | 1.5 mL | 4 × 1.5 mL | 5 × 10 mL |
| MgSO4 (100mM) | 1.5 mL | 2 × 1.5 mL | 3 × 10 mL |
Suidheachadh stòraidh
Còmhdhail fo 0 ° C agus a bhith air a stòradh aig -25 ° C ~ -15 ° C.
Smachd Càileachd
- Gnìomh air fhàgail deEndonuclease:Tha freagairt 50 μL anns a bheil 1 μg de λDNA agus 15 aonadan de RTL2.0 air an gortachadh airson 16 uairean aig 37 ℃ a ’sealltainn an aon phàtran ri smachd àicheil le electrophoresis gel.
- Gnìomh air fhàgail deExonuclease:Tha freagairt 50 μL anns a bheil 1 μg de λDNA air a chnàmh le Hind Ⅲ agus 15 aonadan de RTL2.0 air an goirteachadh airson 16 uairean aig 37 ℃ a’ nochdadh an aon phàtran ri smachd àicheil le electrophoresis gel.
- Gnìomh air fhàgail deNickase:Tha freagairt 50 μL anns a bheil 1 μg de supercoiled pBR322 agus 15 aonadan de RTL2.0 air an gortachadh airson 4 uairean aig 37 ° C a’ nochdadh an aon phàtran ri smachd àicheil le electrophoresis gel.
- Gnìomh air fhàgail deRNase:Tha freagairt 10 μL anns a bheil 0.48 μg de MS2 RNA agus 15 aonadan de RTL2.0 air an gortachadh airson 4 uairean aig 37 ° C a ’sealltainn an aon phàtran ri smachd àicheil le electrophoresis gel.
- E. coli gDNA:Air a thomhas leE.coliinnealan lorg HCD sònraichte, tha nas lugha na 1 aonadan de RTL2.0 ann an 15 aonadE. coligenoma.
Suidheachadh freagairt
Pròtacal Synthesis cDNA
| Co-phàirtean | Toirt |
| Teamplaid RNA a | roghainneil |
| Oligo (dT) 18 ~ 25 (50uM) no measgachadh Random Primer (60uM) | 2 μL |
| dNTP Mix (10mM gach) | 1 µL |
| Inhibitor RNase (40U/uL) | 0.5 μL |
| RTL Reverse Transcriptase 2.0 (15U/uL) | 0.5 μL |
| Bufair RTL 10 × HC | 2 μL |
| Uisge gun niùclas | Suas gu 20 μL |
Notaichean:
1) Is e an dòs a thathar a’ moladh de RNA Iomlan 1ng ~ 1μg
2) B’ e an dòs a chaidh a mholadh de mRNA 50ng ~ 100ng
Teirm-rothaireachd Riaghailtean airson cleachdadh àbhaisteach freagairt:
| Teòthachd (°C) | Uair |
| 25 °Ca | 5 mionaidean |
| 55 °C | 10 mionaideanb |
| 80 °C | 10 mionaidean |
Notaichean:
1) Ma thèid Random Primer Mix a chleachdadh, ceum brosnachaidh aig 25 ° C.
2) Ma thèid measgachadh targaid primer a chleachdadh, ceum brosnachaidh aig 55 ° C airson 10 ~ 30mion.
Pròtacal RT-LAMP
| Co-phàirtean | Toirt | Tùsachadh Deireannach |
| Teamplaid RNA | roghainneil | ≥10 leth-bhreac |
| dNTP measgachadh (10mM) | 3.5 μL | 1.4 mM |
| Prìomh phuingean FIP/BIP (25 ×) | 1 µL | 1.6 μM |
| Prìomh phuingean F3/B3 (25 ×) | 1 µL | 0.2 μM |
| Prìomhairean LoopF/LoopB (25×) | 1 µL | 0.4 μM |
| Inhibitor RNase (40U/μL) | 0.5 μL | 20 U/Reaction |
| RTL Reverse Transcriptase 2.0 (15U/μL) | 0.5 μL | 7.5 U / Freagairt |
| Bst V2 DNA Polymerase (8U/μL) | 1 µL | 8 U/ Freagairt |
| MgSO4 (100mM) | 1.5 μL | 6 mM (8 mM gu h-iomlan) |
| Bufair 10 × HC RTL (no bufair 10 × HC Bst V2) | 2.5 μL | 1 × (2mM Mg2+) |
| Uisge gun niùclas | Suas gu 25 μL | - |
Notaichean:
1) Measgaich le vortexing agus centrifuge goirid airson a chruinneachadh.Goir teòthachd seasmhach aig 65 ° C airson 1 uair.
2) Tha an dà bufair eadar-obrachail agus tha an aon sgrìobhadh aca.
Notaichean
1. Bidh an toradh seo na sholar geal nuair a thèid a stòradh aig -20 ° C.Thoir air falbh e bho -20 ° C agus cuir air deigh airson timcheall air 10 mionaidean.An dèidh leaghadh, faodar a chleachdadh le bhith a 'crathadh agus a' measgachadh.
2.Dh’ fhaodadh an toradh cDNA a bhith air a stòradh aig -20 ° C no -80 ° C no a chleachdadh sa bhad airson freagairt PCR.
3. Gus casg a chuir air truailleadh RNase, feuch an cùm thu an raon deuchainneach glan, agus caith miotagan agus aghaidhean choimheach glan fhad ‘s a tha thu ag obair.
