Kit Mini Extraction DNA
Bidh an uidheamachd seo a’ gabhail ri siostam bufair làn-leasaichte agus teicneòlas glanaidh colbh silica gel, a dh’ fhaodas pìosan DNA 70 bp - 20 kb fhaighinn air ais bho dhiofar cho-chruinneachaidhean de gel agarose TAE no TBE.Faodaidh colbh sùghadh DNA DNA a shùghadh gu sònraichte fo staid làn salainn.A bharrachd air an sin, faodaidh an uidheamachd mìrean DNA a ghlanadh gu dìreach bho thoraidhean PCR, siostaman ath-bhualadh enzymatic no toraidhean DNA amh a gheibhear tro dhòighean eile, agus cuir às do neo-chunbhalachd leithid pròtanan, todhar organach eile, ions salainn neo-organach agus primers oligonucleotide.Faodaidh e dèanamh cinnteach gum faodar an glanadh a chrìochnachadh taobh a-staigh 10-15min.Faodar an DNA fìor-ghlan a chleachdadh gu dìreach airson ligation, cruth-atharrachadh, cnàmhadh enzyme, tar-sgrìobhadh in vitro, PCR, sreath, meanbh-stealladh, msaa.
Suidheachadh stòraidh
Bùth aig -15 ~ -25 ℃ agus còmhdhail aig teòthachd an t-seòmair.
Co-phàirtean
| Co-phàirtean | (100 rxns) |
| GDP bufair | 80 ml |
| Bufair GW | 2 × 20 ml |
| Bufair Elution | 20 ml |
| Colbhan beaga DNA FastPure-G | 100 |
GDP Bufair:Bufair ceangail DNA.
Bufair GW:Bufair nighe;cuir ethanol iomlan leis an tomhas-lìonaidh ainmichte air a’ bhotal mus tèid a chleachdadh.
Bufair Elution:Elution.
Colbhan beaga DNA FastPure-G:Colbhan sèididh DNA.
Tiùban cruinneachaidh 2 ml:Cruinneachadh pìoban airson filterrate.
Stuthan ullaichte
Tiùban sterilichte 1.5 ml, làn ethanol agus isopropanol (nuair a bhios criomag DNA ≤100 bp, cuir 1 tomhas-lìonaidh ris
isopropanol gu gel 1 toirt), amar uisge.
Pròiseas deuchainn
Cuir 80 ml de ethanol ris gus Buffer GW a lagachadh mar a tha air a chomharrachadh air tag mus tèid a chleachdadh, stòradh aig teòthachd an t-seòmair.
Uidheamachd
1. Fuasgladh freagairt PCR
Sgeama às-tharraing gel: Cuir ris an aon mheud Buffer GDP PCR sgeama ath-bheothachaidh fuasgladh freagairt:Cuir ris 5 tursan am bufair tomhas-lìonaidh
2. GDP Obraich a-mach tomhas-lìonaidh an gel (100 μl co-ionann ri 100 mg)
Fuasgail gel
3. Preheat aig 50 ~ 55℃
4. Nigh Ceangal
Cuir ris 300 μL de Buffer GDP*
Cuir 700 μL de Buffer GW ris
Cuir 700 μL de Buffer GW ris
5. Eilidh
Cuir 20 - 30μL de Elution Buffer no uisge deionized ris
Notaichean * Ath-bhualadh PCR ath-bheothachadh fluid às aonais a’ cheum seo
Prògram tarraing gel
1. Às deidh electrophoresis DNA airson pìosan DNA a bhriseadh, cuir às don chriomag stiallach singilte de DNA bhon ghèel agarose fo sholas UV.Thathas a’ moladh pàipear sùghaidh a chleachdadh gus taiseachd follaiseach gel a ghabhail a-steach agus meud an sliseag gel a lughdachadh le bhith a ’toirt air falbh agarose a bharrachd cho math‘ s as urrainn dhut.Cuidich an sliseag gel (às aonais tiùb microcentrifuge) gus an tomhas-lìonaidh aige obrachadh a-mach: Tha meud gelslice 100 mg timcheall air 100 μL, a’ gabhail ris gu bheil an dùmhlachd 1g / ml.
2. Cuir ris an aon mheud Buffer GDP, goir aig 50 ~ 55 ℃ airson 7-10 mionaidean (a rèir meud an gel, atharraich an ùine brosnachaidh gus an sgaoil an gel gu tur).Cuir a-steach an tiùb 2 uair rè an goir.
Δ Cha toir cur-ris 1-3 leabhraichean de GDP Buffer buaidh air èifeachdas ath-bheothachaidh DNA.Ma tha an criomag DNA ri fhaighinn air ais <100 bp, feumar 3 leabhraichean de Buffer GDP a chur ris;nuair a tha an sliseag gel air a sgaoileadh gu tur, cuir 1 tomhas de isopropanol agus measgachadh gu mionaideach, agus an uairsin lean air adhart chun ath cheum.
3. Centrifuge goirid gus an sampall a thoirt gu bonn an tiùba, cuir a-steach an DNA FastPure Mini Colbhan-G a-steach do na tiùban cruinneachaidh 2 ml, gluais am fuasgladh gu faiceallach aig a ’char as àirde de 700 μL aon uair sa
ùine gu na colbhan sìoltachaidh, centrifuge aig 12,000 rpm (13,800 X g) airson 30-60 diogan.
4. Thoir air falbh an fhileadh agus cuir 300 μL de Buffer GDP ris a 'cholbh, goir aig teòthachd an t-seòmair airson 1 min, centrifuge aig 12,000 rpm (13,800 X g) airson 30-60 diogan.
5. Thoir air falbh an fhileadh agus cuir 700 μL de Buffer GW (seall an deach ethanol iomlan a chur ris ro làimh!) Chun a 'cholbh, centrifuge aig 12,000 rpm (13,800 X g) airson 30-60 diogan.
Δ Feuch an cuir thu Buffer GW timcheall balla a’ cholbh assorption, no cuir a-steach còmhdach cùil Buffer GW agus measgachadh e bun os cionn airson 2 - 3 tursan gus cuideachadh le bhith a’ sruthadh an t-salainn gu tur a’ cumail ri balla an tiùba.
6. Dèan ceum 5 a-rithist.
Δ Faodaidh sruthadh le Buffer GW dà uair dèanamh cinnteach gun tèid an salann a thoirt air falbh gu tur agus cuir às don bhuaidh air deuchainnean às deidh sin.
7. Thoir air falbh an fhileadh agus centrifuge an colbh falamh aig 12,000 rpm (13,800 X g) airson 2 min.
8. Cuir a-steach an colbh a-steach do phìob microcentrifuge glan 1.5 ml, cuir 20 - 30 μL de Elution Buffer gu meadhan membran a’ cholbh, goir airson 2 mhionaid, agus an uairsin centrifuge aig 12,000 rpm (13,800 X g) airson 1 min.Thoir air falbh an colbh, stòraich an DNA a gheibhear aig -20 .
Δ Is dòcha gum biodh e na chuideachadh le bhith a’ gluasad supernatant ceum 8 chun cholbh gus elute a-rithist agus preheating an Elution Buffer gu 55 (nuair a bhios criomag DNA> 3 kb) gus èifeachdas ath-bheothachaidh àrdachadh.
Prògram airson bathar-thaighean PCR luchdadh a-nuas
Tha am protocol seo iomchaidh airson mìrean DNA a ghlanadh bho thoraidhean PCR, siostam ath-bhualadh enzymatic agus toraidhean amh DNA eile (a’ toirt a-steach DNA ginteil).Faodaidh am fuasgladh seo diofar nucleotides, primers, primer dimers, moileciuilean salainn, enzyman agus neo-chunbhalachd eile a thoirt air falbh.
1. Goirid centrifuge PCR bathar, enzymatic reaction fuasgladh, agus eile DNA amh bathar.Dèan tuairmse air an tomhas-lìonaidh aca le pipette agus gluais gu tiùb sterilichte 1,5 ml no 2 ml.Cuir ddH2O ris gus an tomhas-lìonaidh suas gu 100 μL;agus airson DNA genomic le dùmhlachd àrd, cuidichidh lagachadh gu 300 μL le ddH2O le bhith ag adhartachadh èifeachdas ath-bheothachaidh.
2. Cuir 5 leabhraichean de Buffer GDP ris, measgachadh gu mionaideach le bhith a 'toirt a-steach tionndadh no vortexing.Ma tha feum air criomag inntinneach DNA> 100 bp, 1.5 leabhraichean a bharrachd (sampaill + Buffer GDP) de ethanol a chur ris.
3. Cuir a-steach an colbh air ais dhan phìob cruinneachaidh, gluais am measgachadh gu colbh, centrifuge aig 12,000 rpm (13,800 × g) airson 30 - 60 diogan.Mas e meud an fhuasglaidh mheasgaichte> 700 µL, cuir a’ cholbh assorption air ais a-steach don phìob cruinneachaidh, gluais am fuasgladh a tha air fhàgail chun cholbh adsorption, agus cuir centrifuge aig 12,000 rpm (13,800 × g) airson 30 - 60 diog.
4. Tha an ath choileanadh a' toirt iomradh air ceum 5 – 8 de phrògram tarraing às 08- 1/Gel.
Iarrtasan
Diofar chruinneachaidhean de gel agarose TAE no TBE;Bathar PCR, siostaman ath-bhualadh enzymatic no toraidhean DNA amh eile a gheibhear tro dhiofar dhòighean.Bha pìosan a chaidh fhaighinn air ais eadar70 bp -20 kb.
Notaichean
Airson cleachdadh rannsachaidh a-mhàin.Chan ann airson a chleachdadh ann am modhan breithneachaidh.
1. Cuir 80 ml de ethanol gus Buffer GW a lagachadh mar a tha air a chomharrachadh air an taga mus tèid a chleachdadh, a stòradh aig teòthachd an t-seòmair.
2. Ma tha an GDP Buffer furasta a shìoladh rè stòradh aig teòthachd ìosal, faodar a chuir aig teòthachd an t-seòmair airson ùine mus tèid a chleachdadh.Ma tha feum air, faodar a theasachadh ann an amar uisge 37 ℃ gus an tèid an sileadh gu tur a sgaoileadh, agus an uairsin faodar a chleachdadh às deidh measgachadh.
3. Suidhich teòthachd an amar uisge gu 50 ~ 55 ℃ ro-làimh.
4. Ann an ceum 1 de phrògram às-tharraing 08-1/Gel, lughdaichidh lùghdachadh meud sliseag gel gu mòr an ùine fuasglaidh agus àrdaichidh e èifeachdas ath-bheothachaidh (Tha DNA sreathach furasta a uisgeachadh nuair a bhios e an-còmhnaidh fosgailte aig teòthachd àrd).Na cuir a-mach gel DNA gu UV airson ùine mhòr, oir faodaidh solas ultraviolet milleadh DNA adhbhrachadh.
5. Fuasgail an gel ann an ceum 2 de phrògram às-tharraing 08- 1/Gel gu tur, air neo bidh buaidh mhòr air èifeachdas ath-bheothachaidh DNA.
6. Preheat Elution Buffer no ddH2O gu 55 ℃ , a tha cuideachail gus èifeachdas DNA elution a leasachadh.Thathas a’ moladh DNA a stòradh ann an elent de 2.5 mM Tris-HCl, pH 7.0 - 8.5.
