M-MLV Neoscript Reverse Transcriptase
Is e transcriptase cùil a th’ ann an Neoscript Reverse Transcriptase a gheibhear le sgrìonadh mùthaidh den ghine M-MLV de thùs bhìoras leucemia Moloney murine agus faireachdainn ann an E.coli.Bidh an enzyme a’ toirt air falbh gnìomhachd RNase H, tha fulangas teothachd nas àirde aige, agus tha e freagarrach airson tar-sgrìobhadh àrd-teòthachd air ais.Mar sin, tha e cuideachail cuir às do bhuaidhean mì-fhàbharach structar àrd-ìre RNA agus factaran neo-shònraichte air synthesis cDNA, agus tha seasmhachd nas àirde aige agus comas synthesis tar-sgrìobhaidh air ais.Tha seasmhachd nas àirde aig an enzyme agus comas synthesis tar-sgrìobhaidh cùil.
Co-phàirtean
1.200 U / μL Neoscript Reverse Transcriptase
2.5 × Bufair ciad-shrann (roghainneil)
* 5 × Chan eil dNTP ann am Bufair First-Strand, feuch an cuir thu dNTPn nuair a bhios tu ag ullachadh an t-siostam freagairt
Iarrtas air a mholadh
1.QRT-PCR aon-cheum.
2.Lorg bhìoras RNA.
Suidheachadh stòraidh
-20 ° C airson stòradh fad-ùine, bu chòir a mheasgachadh gu math mus tèid a chleachdadh, seachain reothadh tric.
Mìneachadh Aonad
Tha aon aonad a’ toirt a-steach 1 nmol de dTTP ann an 10 mionaidean aig 37 ° C a’ cleachdadh poly(A)•oligo(dT)25mar theamplaid/primer.
Smachd Càileachd
1.Purity electrophoretic SDS-PAGE nas àirde na 98%.
2.Cugallachd leudachaidh, smachd baidse-gu-baidse, seasmhachd.
3.Gun ghnìomhachd nuclease exogenous, gun truailleadh endonuclease exogenous no exonuclease
Suidheachadh freagairt airson fuasgladh freagairt ciad slabhraidh
1.Ag ullachadh measgachadh reaction
| Co-phàirtean | Toirt |
| Oligo(dT)12-18 Prìomhair no Random Primera No Primers Sònraichte Gineb | 50 pm |
| 50 pm (20-100 pm) | |
| 2 feasgar | |
| 10 mM dNTP | 1 µL |
| Teamplaid RNA | Iomlan RNA≤ 5μg;mRNA≤ 1 μg |
| Gun RNase dH2O | Gu 10 μL |
Notaichean:a/b: Feuch an tagh thu diofar sheòrsaichean primers a rèir na feumalachdan deuchainneach agad.
2.Teas aig 65 ° C airson 5 mionaidean agus fionnar gu luath air deigh airson 2 mhionaid.
3.Cuir na co-phàirtean a leanas ris an t-siostam gu h-àrd gu tomhas-lìonaidh iomlan de 20µL agus measgachadh gu socair:
| Co-phàirtean | Meud (μL) |
| 5 × Bufair First-Strand | 4 |
| Ath-sgrìobhadh Neoscript Reverse (200 U/μL) | 1 |
| Neach-dìon RNase (40 U / μL) | 1 |
| Gun RNase dH2O | Gu 20 μL |
4.Please dèan an ath-bhualadh a rèir nan suidheachaidhean a leanas:
(1) Ma thèid Random Primer a chleachdadh, bu chòir an ath-bhualadh a dhèanamh aig 25 ℃ airson 10mins, agus an uairsin aig 50 ℃ airson 30 ~ 60mins;
(2) Ma tha Oligo dT no primers sònraichte air an cleachdadh, bu chòir an ath-bhualadh a dhèanamh aig 50 ℃ airson 30 ~ 60mins.
5.Teas aig 95 ℃ airson 5 mionaidean gus Neoscript Reverse Transcriptase a chuir an gnìomh agus crìoch a chuir air an ath-bhualadh.
6.Faodar toraidhean tar-sgrìobhaidh cùil a chleachdadh gu dìreach ann am freagairt PCR agus ath-bhualadh cainneachdail PCR, no a stòradh aig -20 ℃ airson ùine mhòr.
PCR Rgnìomh:
1.Ag ullachadh measgachadh reaction
| Co-phàirtean | dùmhlachd |
| Bufair 10 × PCR (dNTP an-asgaidh, Mg²+ an-asgaidh) | 1 × |
| dNTPs (10mM gach dNTP) | 200 μM |
| 25 mM MgCl2 | 1-4 mM |
| DNA Polymerase (5U/μL) | 2-2.5 U |
| Primer 1 (10 μM) | 0.2-1 μM |
| Primer 2 (10 μM) | 0.2-1 μM |
| Teamplaida | ≤10% Fuasgladh ath-bhualadh slabhraidh (2 μL) |
| dhh2O | Suas gu 50 μL |
Notaichean:a: Ma thèid cus fuasgladh ath-bhualadh slabhraidh a chur ris, dh’ fhaodadh gun tèid casg a chuir air freagairt PCR.
2.Modh-obrach freagairt PCR
| Ceum | Teòthachd | Uair | Rothaichean |
| Ro-dhiadhachadh | 95 ℃ | 2-5 mionaidean | 1 |
| Dì-nàdarachadh | 95 ℃ | 10-20 diog | 30-40 |
| Annealing | 50-60 ℃ | 10-30 diog | |
| Leudachadh | 72 ℃ | 10-60 diog |
Notaichean
1.Freagarrach airson ath-sgrìobhadh cùil optimization teòthachd anns an raon de 42 ℃ ~ 55 ℃.
2.Tha seasmhachd nas fheàrr aige, tha e freagarrach airson leudachadh tar-chuir air ais aig teòthachd àrd.A bharrachd air an sin, tha e fàbharach a bhith a’ dol tro roinnean structarail iom-fhillte de RNA gu h-èifeachdach.Cuideachd, efreagarrach airson lorgadh fluorescence cainneachdail RT-PCR aon-cheum.
3.Co-chòrdalachd math le diofar enzyman leudachaidh PCR agus tha e freagarrach airson ath-bheachdan RT-PCR le cugallachd àrd.
4.Freagarrach airson freagairt fluorescence aon-cheum cainneachdail RT-PCR àrd, gu h-èifeachdach ag adhartachadh ìre lorgaidh dùmhlachd ìosal de theamplaidean.
5.Freagarrach airson togail leabharlainn cDNA.
