Kit genotyping na luchaige

Àireamh cat: HCR2021A

Is e pasgan a th’ anns an toradh seo a chaidh a dhealbhadh airson a bhith ag aithneachadh genotypes luchag gu sgiobalta, a’ toirt a-steach às-tharraing amh DNA agus siostam leudachaidh PCR.Faodar an toradh a chleachdadh airson leudachadh PCR gu dìreach bho earball na luchaige, cluais, ladhar agus stuthan eile às deidh sgoltadh sìmplidh le Lysis Buffer agus Proteinase k.Gun cnàmhadh thar oidhche, às-tharraing phenol-chloroform no glanadh colbhan, a tha sìmplidh agus a ’giorrachadh ùine deuchainnean.Tha an toradh freagarrach airson leudachadh air pìosan targaid suas gu 2kb agus ath-bheachdan PCR ioma-fhillte le suas ri 3 paidhrichean de primers.Anns a’ mheasgachadh PCR dìreach 2 × inneal-luchag tha DNA polymerase a chaidh innleachadh gu ginteil, Mg²⁺, dNTPs agus siostam bufair làn-leasaichte gus èifeachdas leudachaidh àrd agus fulangas casg a thoirt seachad, gus an urrainnear ath-bheachdan PCR a dhèanamh le bhith a’ cur teamplaid agus primers ris agus ag ath-uisgeachadh an toraidh gu 1 ×.Tha bunait follaiseach “A” aig an toradh PCR a tha air a mheudachadh leis an toradh seo aig ceann 3 ′ agus faodar a chleachdadh gu dìreach airson clonadh TA às deidh glanadh.

Co-phàirtean

Cumhachan stòraidh

Bu chòir bathar a stòradh aig -25 ~ -15 ℃ airson 2 bhliadhna.Às deidh leaghadh, faodar Lysis Buffer a stòradh aig 2 ~ 8 ℃ airson ioma-chleachdadh geàrr-ùine, agus measgachadh gu math nuair a bhios tu a ’cleachdadh.

Iarrtas

Tha an toradh seo freagarrach airson mion-sgrùdadh luchainn, lorg transgenic, genotyping agus mar sin air adhart.

Feartan

1.Obrachadh sìmplidh: chan eil feum air DNA genomic a thoirt a-mach;

2.Iarrtas farsaing: freagarrach airson leudachadh dìreach air diofar stuthan luchag.

Stiùiridhean

1.Sgaoileadh DNA genomic

1) Ag ullachadh lysate

Thathas ag ullachadh lysate meitabileach a rèir an àireamh de shamhlaichean luchag a tha rin lysate (bu chòir lysate maothraidh ullachadh air an làrach a rèir an dòs agus measgachadh gu mionaideach airson a chleachdadh), agus tha a’ chuibhreann de ath-bheachdan a tha a dhìth airson aon shampall mar a leanas:

2) Eisimpleir Ullachaidh agus Lysis

Cleachdadh Fìne a tha air a mholadh

Gabh tomhas iomchaidh de shamhlaichean clò luchag ann an tiùban centrifuge glan, cuir 200μL de lysate clò ùr gu gach tiùb centrifuge, vortex agus crathadh, an uairsin goir aig 55 ℃ airson 30m, agus an uairsin teas aig 98 ℃ airson 3 mionaidean.

3) Centrifugation

Crith an lysate gu math agus an centrifuge aig 12,000 rpm airson 5 mionaidean.Faodar an supernatant a chleachdadh mar theamplaid airson leudachadh PCR.Ma tha feum air an teamplaid airson a stòradh, gluais an supernatant gu tiùb centrifuge sterile eile agus stòr aig -20 ℃ airson 2 sheachdain.

2.Meudachadh PCR

Thoir air falbh am measgachadh PCR Direct 2 × fìnealta na luchaige bho -20 ℃ agus leaghadh air deigh, measgachadh bun os cionn agus ullaich an siostam freagairt PCR a rèir a ’chlàir a leanas (obraich air deigh):

Thoir an aire:

a) Cha bu chòir an t-suim a chaidh a chur ris a bhith nas àirde na 1/10 den t-siostam, agus ma thèid cus a chur ris, dh’ fhaodadh gun tèid casg a chuir air leudachadh PCR.

Cùmhnantan PCR air am moladh

Thoir an aire:

a) Teòthachd annealing: A thaobh luach Tm an primer, thathas a’ moladh an teòthachd annealing a shuidheachadh gu luach Tm nas lugha den primer +3 ~ 5 ℃.

Duilgheadasan Coitcheann agus Fuasglaidhean

1.Gun stiallan cuimsichte

1) Toradh lysis cus.Tagh an àireamh de theamplaid as iomchaidh, mar as trice chan eil barrachd air 1/10 den t-siostam;

2) Meud sampall ro mhòr.Dilute an lysate 10 tursan agus an uairsin leudaich, no lughdaich meud an t-sampall agus ath-lysis;

3) Chan eil sampallan clò-bhualaidh ùr.Thathas a’ moladh sampallan clò ùr a chleachdadh;

4) droch chàileachd primer.Cleachd DNA genomic airson leudachadh gus càileachd primer a dhearbhadh agus dealbhadh primer a bharrachadh.

2.Meudachadh neo-shònraichte

1) Tha an teòthachd annealing ro ìosal agus tha an àireamh baidhsagal ro àrd.Meudaich an teòthachd annealing agus lughdaich an àireamh de chuairtean;

2) Tha dùmhlachd teamplaid ro àrd.Lùghdaich an àireamh de theamplaid no caolaich an teamplaid 10 tursan às deidh an leudachadh;

3) Sònrachas primer truagh.Dèan an dealbhadh primer as fheàrr.

Notaichean

1.Gus tar-thruailleadh eadar sampallan a sheachnadh, bu chòir grunn innealan samplachaidh ullachadh, agus faodar uachdar nan innealan a ghlanadh le fuasgladh sodium hypochlorite 2% no inneal-glanaidh searbhag niuclasach às deidh gach samplachadh ma tha feum air a-rithist.

2.Thathas a’ moladh innealan luchag ùra a chleachdadh, agus cha bu chòir an tomhas samplaidh a bhith ro mhòr gus nach toir e buaidh air toraidhean leudachaidh.

3.Bu chòir do Lysis Buffer reothadh tric a sheachnadh, agus faodar a stòradh aig 2 ~ 8 ℃ airson ioma-chleachdadh geàrr-ùine.Ma thèid a stòradh aig teòthachd ìosal, faodaidh sileadh tachairt, agus feumar a sgaoileadh gu tur mus tèid a chleachdadh.

4.Bu chòir PCR Mix reothadh tric a sheachnadh, agus faodar a stòradh aig 4 ℃ airson ath-chleachdadh geàrr-ùine.

5.Chan eil an toradh seo ach airson sgrùdadh deuchainneach saidheansail agus cha bu chòir a chleachdadh ann am breithneachadh no làimhseachadh clionaigeach.