Suidhich Kit PCR dìreach
Àireamh cat: HCR2020A
Tha Plant Direct PCR Kit freagarrach airson leudachadh dìreach air duilleagan planntrais, sìol, msaa, agus faodar a chleachdadh airson sgrìonadh àrd-threòrachadh de shamhlaichean planntrais anns nach eil polysaccharides agus polyphenols.Tha barrachd fulangas aig an leudachadh dìreach DNA polymerase stèidhichte air an mean-fhàs stiùirichte ri luchd-dìon PCR ann an lusan.Aig an aon àm, tha e a 'cumail suas àrd coileanadh leudachaidh, a tha freagarrach airson meudachadh DNA mìrean taobh a-staigh 5 kb.Faodar am bufair sònraichte Lysis A anns a’ phiseag a chleachdadh gus clòthan planntrais ùr no reòta a sgeadachadh.Tha e furasta obrachadh agus faodar an lysate a chleachdadh mar theamplaid airson leudachadh gun ghlanadh.Tha riochdairean dìon anns an t-siostam a leigeas le sampallan amh a bhith air an àrdachadh gu h-èifeachdach às deidh reothadh is leaghadh.Chan fheum 2 × Plant Direct Master Mix ach primers agus teamplaidean a chuir ris gus freagairt leudachaidh a dhèanamh, mar sin a’ lughdachadh gnìomhachd pìobaireachd agus a’ leasachadh trochur lorg agus ath-riochdachadh thoraidhean.
Co-phàirtean
| Co-phàirtean | 50 RXNS | 200 RXNS |
| 2 × Plant Direct Master Mix | 1.25 ml | 4 × 1.25 ml |
| Bufair Lysis dìreach planntrais A | 5 ml | 20 ml |
| Lusan dìreach Lysis Buffer B* | 5 ml | 20 ml |
* Tha Plant Direct Lysis Buffer B na reagent roghainneil, a thathas a’ cleachdadh gus planntrais dìreach Lysis Buffer A a neodachadh airson ùine stòraidh shampaill a leudachadh.Faodar a chleachdadh a rèir an t-suidheachaidh fhìor.
Cumhachan stòraidh
2 × Plant Direct Master Mix, stòradh aig -30 ~ -15 ℃ agus seachain reothadh is leaghadh;Plant Direct Lysis Buffer, stòradh aig -30 ~ -15 ℃ no 2 ~ 8 ℃.
Pròiseas deuchainn
Pròiseas Eisimpleir-Lusan Leaf
Dòigh dhìreach:Thathas a 'moladh duilleagan òga a chleachdadh.Cleachd punch toll le trast-thomhas stèidhichte de 0.5 - 3 mm gus sampall beag agus èideadh fhaighinn, agus an uairsin cuir an sampall gu dìreach ris an t-siostam PCR (thathas a’ moladh siostam 50 μl).Thoir an aire, dèan cinnteach gu bheil an sampall anns an fhuasgladh PCR agus chan ann an aghaidh balla an tiùba.Ma thèid PCR dìreach a chleachdadh gus pìosan fada agus sampallan iom-fhillte a mheudachadh, le bhith a’ cleachdadh sampall le trast-thomhas nas lugha (0.5 - 1 mm) mar theamplaid faodaidh e cuideachadh gus toraidhean nas fheàrr fhaighinn.
Modh bleith lysis:Thathas a 'moladh duilleagan òga a chleachdadh.Gabh pìos beag de dhuilleag (timcheall air 1 - 3 mm ann an trast-thomhas), cuir e ann an 20 μl Plant Direct Lysis Buffer Ab, agus bleith e cho mòr ‘s as urrainn dhut (faodar an ceum seo a dhèanamh le bhith a’ brùthadh na duilleige le tip pipette 100 μl gus an sampall a mhùchadh).Ma thèid meudan nas motha de stuth duille a chleachdadh (na bi nas àirde na 7 mm), àrdaich meud bufair caolachaidh gu 50 μl.Às deidh na duilleagan a bhith air an talamh, bu chòir don fhuasgladh nochdadh uaine.Às deidh centrifugation goirid, cuir 1 μl den supernatant ris an t-siostam PCR mar templatec ath-bhualadh .
Modh lysis teirmeach:Thathas a 'moladh duilleagan òga a chleachdadh.Gabh pìos beag de dhuilleag (timcheall air 1 - 3 mm ann an trast-thomhas), cuir e ann an 20 μl Plant Direct Lysis Buffer A, agus teas e aig 95 ° C airson 5 - 10 mionaidean.Faodar an ùine lysis a leudachadh gu h-iomchaidh airson duilleagan a tha duilich a lyse (gun a bhith nas fhaide na 20 min).Ma thèid meudan nas motha de stuth duille a chleachdadh (na bi nas àirde na 7 mm), àrdaich meud bufair caolachaidh gu 50 μl.An dèidh teasachadh, centrifuge goirid, agus cuir 1 μl de supernatant ris an t-siostam PCR mar fhreagairt templateb.
Pròiseas Eisimpleir- sìol lusan
Modh bleith lysis:Cleachd scalpel airson sìol a ghearradh le trast-thomhas de 5 mm, cuir iad gu 100 μl de Plant Direct Lysis Buffer A, agus bleith an sampall le tip pìobaireachd no innealan eile.Vortex goirid agus leig seachad seasamh aig teòthachd an t-seòmair airson 3 - 5 mionaidean.Dèan cinnteach gu bheil an sampall sìol air a thumadh anns a’ bhufair caolachaidh.Às deidh centrifugation goirid, cuir 1 μl den supernatant ris an t-siostam PCR mar theamplaid freagairt.
Modh lysis teirmeach:Cleachd sgalpel airson sìol a ghearradh le trast-thomhas de 5 mm, cuir iad gu 100 μl de Plant Direct Lysis Buffer A, agus teas aig 95 ° C airson 5 - 10 mionaidean.Faodar an ùine lysis a leudachadh gu h-iomchaidh airson duilleagan a tha duilich a lyse (gun a bhith nas fhaide na 30 min).An dèidh teasachadh, centrifuge goirid, agus cuir 1 μl supernatant ris an t-siostam PCR mar fhreagairt templateb.
a.Faodar siosar no innealan eile a chleachdadh cuideachd airson sampallan de mheud iomchaidh a ghearradh;ma thèid am punch no an siosar ath-chleachdadh, bu chòir an glanadh le fuasgladh sodium hypochlorite 2% ro gach cleachdadh gus casg a chuir air tar-thruailleadh eadar sampallan.
b.Dèan cinnteach gu bheil am Bufair Lysis Plant Direct làn leaghadh mus tèid a chleachdadh.Ma tha am bufair slaodach no ma tha precipitates ann, faodar a theasachadh aig 37 ℃ gus a leaghadh gu tur mus tèid a chleachdadh.
c.Faodar meud an teamplaid anns an t-siostam ath-bhualadh atharrachadh gu h-iomchaidh a rèir an eadar-dhealachaidh ann an meud stuth planntrais agus caolachadh a chaidh a chur ris.
Bufair Lysis dìreach planntrais
Chaidh an Plant Direct Lysis Buffer A a tha sa bhathar seo a leasachadh gu teann gus genoma a’ mhòr-chuid de fhigheagan planntrais a leigeil ma sgaoil agus tha e freagarrach airson stòradh geàrr-ùine de phlanntaichean amh aig 4 ℃.Ma dh'fheumas an sampall a bhith air a stòradh airson ùine nas fhaide (me, 1 - 2 mìosan), thathar a 'moladh an supernatant a ghluasad gu tiùb EP ùr agus a stòradh aig -20 ℃.Gus na sampallan a stòradh ann an dòigh nas seasmhaiche, cuir meud co-ionann de Plant Direct Lysis Buffer B ris an supernatant a chaidh a ghluasad, measgachadh gu math agus stòradh aig -20 ℃.Bidh an ùine stòraidh seasmhach ag atharrachadh a rèir sampallan planntrais agus stàitean.
Siostam freagairt
| dhh2O | Suas gu 20.0 µl | Gu 50.0 µl |
| 2 × Plant Direct Master Mixa | 10.0 µl | 25.0 µ |
| Primer 1 (10 µM) | 0.8 µl | 2.0 µl |
| Primer 2 (10 µM)b | 0.8 µl | 2.0 µl |
| Sampall duilleag lus/earrann amh(Thoir sùil air giullachd sampall) | 0.5 - 3 mm diosc duille / x µl | 0.5 - 3 mm diosc duille / x µl |
a.Tha Mg2+aig dùmhlachd deireannach de 2 mM.
b.Thathas a’ moladh dùmhlachd deireannach de 0.4 μM a chleachdadh airson gach primer.Bidh cus cleachdadh de primers a’ leantainn gu barrachd leudachaidh neo-shònraichte.
c.Faodar an ìre de shampall a thèid a chleachdadh atharrachadh a rèir an t-suidheachaidh fhìor.Faodar an t-suim a thathar a’ cleachdadh ann an aon fhreagairt de shampall lysed amh atharrachadh eadar 2% - 20% de mheud iomlan an ath-bhualadh.Le bhith a’ cleachdadh cus shamhlaichean faodaidh fàilligeadh leudachaidh adhbhrachadh.
Prògram freagairt
| Ceumannan | Teòthachd | Uair |
| Dì-nàdarachadh tùsail | 98 ℃ | 5 min |
| Dì-nàdarachadh | 95 ℃ | 10 diog |
| Annealing | 58 ~ 72 ℃ | 15 diog |
| Leudachadh | 72 ℃ | 30 diog |
| Leudachadh Deireannach | 72 ℃ | 5 min |
a.Bidh dì-nàdarachadh tùsail (98 ℃, 5 mion) a’ brosnachadh lysis de stuth planntrais, a’ leigeil ma sgaoil DNA genomic a ghabhas cleachdadh airson leudachadh PCR.Na giorraich an ùine no lughdaich an teòthachd.
b.Thathas a 'moladh a shuidheachadh co-ionann ris an luach Tm primer no 2 ~ 4 ℃ nas àirde na luach Tm.Tha an àrdachadh dìreach DNA polymerase a thathar a’ cleachdadh anns a’ bhathar seo eadar-dhealaichte bho àbhaisteach Taq DNA polymerase, agus tha riatanasan sònraichte aige airson an teòthachd annealing ath-bhualadh ； faodaidh cleachdadh teòthachd àrd annealing lùghdachadh èifeachdach a thoirt air leudachadh neo-shònraichte agus èifeachdas leudachaidh a leasachadh.Airson teamplaidean iom-fhillte, faodar an leudachadh èifeachdach a choileanadh le bhith ag atharrachadh teòthachd annealing agus a’ leudachadh ùine leudachaidh.
c.Ma tha fad an toraidh leudachaidh ≤1 kb, tha an ùine leudachaidh air a shuidheachadh aig 30 sec / kb;ma tha fad an toraidh leudachaidh> 1 kb, tha an ùine leudachaidh air a shuidheachadh aig 60 sec / kb.
d.Airson sampaill iom-fhillte no sampaill le toradh leudachaidh ìosal, faodar an àireamh de chearcaill àrdachadh gu h-iomchaidh gu cearcallan 40 -50.
Iarrtasan
Tha e iomchaidh airson leudachadh dìreach air stuthan planntrais agus sgrìonadh àrd-threabhadh de shamhlaichean planntrais anns nach eil polysaccharides agus polyphenols.
Notaichean
Airson cleachdadh rannsachaidh a-mhàin.Chan ann airson a chleachdadh ann am modhan breithneachaidh.
1. Airson leudachadh planntrais amh no leudachadh dìreach, thathas a’ moladh DNA genomic purraichte a chleachdadh mar smachd adhartach mus tòisich thu air an deuchainn gus dèanamh cinnteach gu bheil an siostam, na primers agus na h-obraichean ceart.
2. Tha gnìomhachd dearbhaidh làidir aig an àrdachadh dìreach DNA polymerase a thathar a 'cleachdadh anns a' ghoireas seo.Ma dh’ fheumar clonadh TA a dhèanamh, thathas a’ moladh an DNA a ghlanadh mus cuir thu an adenine ris.
3. Stiùireadh Dealbhadh Primer:
a.Thathas a’ moladh gum bu chòir G no C a bhith aig a’ bhunait mu dheireadh aig ceann 3 ′ den primer.
b.Bu chòir mì-chothromachadh leantainneach a sheachnadh anns na 8 bonn mu dheireadh aig deireadh 3 ′ den primer.c.Seachain structaran fuilt aig deireadh 3 ′ den primer.
d.Cha bu chòir eadar-dhealachaidhean ann an luach Tm an primer air adhart agus an primer cùil a bhith nas àirde na 1 ℃ agus bu chòir an luach Tm atharrachadh gu 60 ~ 72 ℃ (Thathas a ’moladh Primer Premier 5 gus an luach Tm obrachadh a-mach).
e.Cha bu chòir sreathan primer a bharrachd a bharrachd nach eil air am maidseadh leis an teamplaid a bhith air an toirt a-steach nuair a thathar a’ tomhas luach primer Tm.
f.Thathas a 'moladh gum bi susbaint GC den primer 40% -60%.
g.Bu chòir an cuairteachadh iomlan de A, G, C agus T anns a’ primer a bhith cho rèidh sa ghabhas.Seachain a bhith a’ cleachdadh roinnean le susbaint àrd GC no AT.
h.Seachain sreathan co-phàirteach de 5 no barrachd bhunaitean an dara cuid taobh a-staigh an primer no eadar dà primers agus seachain sreathan co-phàirteach de 3 no barrachd bhunaitean aig deireadh 3 ′ de dhà primers.
i.Cleachd gnìomh NCBI BLAST gus sgrùdadh a dhèanamh air sònrachas an primer gus casg a chuir air leudachadh neo-shònraichte.
