Proteinase K mNGS (leaghan)
Tha Proteinase K na protease serine seasmhach le sònrachas substrate farsaing.Bidh e a’ lughdachadh mòran phròtainean anns an stàit dhùthchasach eadhon an làthair innealan-glanaidh.Tha fianais bho sgrùdaidhean structar criostail agus moileciuil a’ nochdadh gu bheil an enzyme a’ buntainn ris an teaghlach subtilisin le triad catalytach làrach gnìomhach (Asp39-Tha aige69-Sear224).Is e am prìomh làrach airson cleavage an ceangal peptide ri taobh a’ bhuidheann carboxyl de amino-aigéid aliphatic agus aromatic le buidhnean alpha amino dùinte.Tha e air a chleachdadh gu cumanta airson a shònrachas farsaing.Tha am proteinase K seo air a dhealbhadh gu sònraichte airson mNGS.An coimeas ris an proteinase K eile, tha eadhon nas lugha de thruailleadh searbhag niuclasach ann leis an aon choileanadh enzymatic, a dh’ fhaodadh dèanamh cinnteach à tagradh mNGS sìos an abhainn.
Cumhachan stòraidh
2-8 ℃ airson 2 bhliadhna
Sònrachadh
| Coltas | Gun dath gu leaghan donn aotrom |
| Gnìomhachd | ≥800 U/ml |
| dùmhlachd pròtain | ≥20 mg/ml |
| Nickase | Cha deach gin a lorg |
| DNA | Cha deach gin a lorg |
| RNase | Cha deach gin a lorg |
Feartan
| EC àireamh | 3.4.21.64(Ath-mheasgadh bhon chlàr Tritirachium) |
| Puing isoelectric | 7.81 |
| pH as fheàrr | 7.0- 12.0 Fig. 1 |
| An teòthachd as fheàrr | 65 ℃ Fig. 2 |
| seasmhachd pH | pH 4.5- 12.5 (25 ℃, 16 h) Fig. 3 |
| Seasmhachd teirmeach | Gu h-ìosal 50 ℃ (pH 8.0, 30 min) Fig. 4 |
| Seasmhachd stòraidh | Thairis air gnìomhachd 90% airson 12 mìosan aig 25 ℃ |
| Gnìomhaichean | SDS, urea |
| Luchd-bacadh | Diisopropyl fluorophosphate;fluoride phenylmethylsulfonyl |
Iarrtasan
1. Inneal breithneachaidh ginteil
2. Innealan às-tharraing RNA agus DNA
3. Thoir a-mach co-phàirtean neo-phròtain bho fhigheagan, truailleadh neo-chunbhalachd pròtain, leithid DNAbanachdachan agus ullachadh heparin
4. Ag ullachadh DNA cromosome le electrophoresis pulsed
5. Blot an iar
6. Enzymatic glycosylated albumin reagents in vitro diagnosis
Earalasan
Cleachd miotagan dìon agus goggles nuair a bhios tu a’ cleachdadh no a’ tomhas cuideam, agus cùm deagh fhionnarachadh às deidh a chleachdadh.Dh’ fhaodadh an toradh seo ath-bhualadh mothachaidh craiceann adhbhrachadh agus irioslachd mòr sùla.Ma thèid anail a-steach, faodaidh e comharraidhean aileirdsidh no asthma no dyspnea adhbhrachadh.Dh’ fhaodadh irioslachd analach adhbhrachadh.
Mìneachadh aonad
Tha aon aonad (U) air a mhìneachadh mar an ìre de enzyme a dh’ fheumar gus casein a hydrolyze gus 1 μmol a dhèanamhtyrosine gach mionaid fo na cumhaichean a leanas.
Ag ullachadh reactaran
Reagent I: Chaidh 1g cùisin bainne a sgaoileadh ann an 50ml de fhuasgladh sodium phosphate 0.1M (pH 8.0), air a ghintinn ann an 65-70 ℃ uisge airson 15 mionaidean, air a ghluasad agus air a sgaoileadh, air fhuarachadh le uisge, air atharrachadh le sodium hydroxide gu pH 8.0, agus tomhas-lìonaidh stèidhichte 100 ml.
Reagent II: searbhag trichloroacetic 0.1M, acetate sodium 0.2M, searbhag acetic 0.3M.
Reagent III: 0.4M Na2CO3fuasgladh.
Reagent IV: Forint reagent air a lagachadh le uisge fìor-ghlan airson 5 tursan.
Reagent V: Dìluent einnsein: fuasgladh sodium phosphate 0.1M (pH 8.0).
Reagent VI: fuasgladh tyrosine: 0, 0.005, 0.025, 0.05, 0.075, 0.1, 0.25 umol / ml tyrosine air a sgaoileadh le 0.2M HCl.
Modh-obrach
1. Tha 0.5ml de dh'imoibrí I air a bhlàthachadh ro-làimh gu 37 ℃, cuir 0.5ml de fhuasgladh enzyme, measgachadh gu math, agus goir aig37 ℃ airson 10 mionaidean.
2. Cuir 1ml de imoibrí II ris gus stad a chur air an ath-bhualadh, measgachadh gu math, agus lean air adhart leis an goir airson 30 mionaid.
3. Centrifugate reaction fuasgladh.
4. Gabh 0.5ml supernatant, cuir 2.5ml reagent III, 0.5ml reagent IV, measgachadh gu math agus goir aig 37 ℃airson 30 mionaid.
5. OD660air a dhearbhadh mar OD1;buidheann smachd bàn: tha reagent 0.5ml V air a chleachdadh an àite enzymefuasgladh gus OD a dhearbhadh660mar OD2, OD = OD1-OD2.
6. L-tyrosine lùb àbhaisteach: 0.5mL dùmhlachd eadar-dhealaichte L-tyrosine fuasgladh, 2.5mL Reagent III, 0.5mL Reagent IV ann 5mL centrifuge tube, goir ann an 37 ℃ airson 30mion, lorg airson OD660airson dùmhlachd eadar-dhealaichte de L-tyrosine, fhuair e an lùb àbhaisteach Y = kX + b, far a bheil Y an dùmhlachd L-tyrosine, is e X OD600.
Àireamhachadh
2: Meud iomlan de fhuasgladh freagairt (mL)
0.5: Meud fuasgladh enzyme (mL)
0.5: Meud lionn freagairt air a chleachdadh ann an dearbhadh chromogenic (mL)
10: Ùine freagairt (mion)
Df: caolachadh iomadaidh
C: dùmhlachd enzyme (mg/mL)
Iomraidhean
1. Wieger U & Hilz H. FEBS Lett.(1972);23:77.
2. Wieger U & Hilz H. Biochem.Biophys.Res.Comunn.(1971);44:513.
3. Hilz, H.et al.,Eur.J. Biochem.(1975);56: 103-108.
4. Sambrook Jet al., Cloning Molecular: Leabhar-làimhe Obair-lann, 2na deasachadh, Cold Spring HarbourLaboratory Press, Cold Spring Harbour (1989).
Figearan
Fig.1 As fheàrr pH
Fuasgladh bufair 100mM: pH6.0-8.0, Na-phosphate;pH8.0-9.0, Tris-HCl;pH9.0-12.5, Glycine-NaOH.Co-chruinneachadh enzyme: 1mg/mL
Fig.2 An teòthachd as fheàrr
Ath-bhualadh ann am bufair K-phosphate 20 mM pH 8.0.Dùmhlachd enzyme: 1 mg / mL
Fig.3 pH Seasmhachd
25 ℃, 16 h-làimhseachadh le fuasgladh bufair 50 mM: pH 4.5- 5.5, Acetate;pH 6,0-8,0, Na-phosphate;pH 8.0-9.0, Tris-HCl.pH 9,0- 12,5, Glycine-NaOH.Dùmhlachd enzyme: 1 mg / mL
Fig.4 Teirmeach seasmhachd
Làimhseachadh 30 min le bufair Tris-HCl 50 mM, pH 8.0.Dùmhlachd enzyme: 1 mg / mL
Fig.5 Stòradh stàbuillty at 25 ℃
